Purification d'ADN génomique de levures

Avec 100 mg de cellules, ce protocole permet d'extraire entre 500 ng et quelques micro grammes d'ADN génomique (mesuré avec un Qubit). Ce protocole repose sur une lyse enzymatique des cellules et une purification avec des colonnes de silice.

Ce protocole de purification de l'ADN génomique ne fait pas appel à un kit et décrit en détail toutes les solutions employées.

L'utilisation de sphéroplastes

Pour extraire l'ADN de levure, la partie la plus difficile est la lyse cellulaire. Des techniques physiques (billes) ou chimique (SDS ou autre détergent) ne sont pas suffisantes. 

Pour une lyse cellulaire optimale, on passe par la formation de sphéroplastes. Les sphéroplastes sont des levures dont la paroi cellulaire a été partiellement dégradée par des enzymes comme la Zymolyase. Les sphéroplastes sont fragiles et plus sensibles à la lyse cellulaire. C'est aussi cette approche qui est utilisée pour modifier les levures.

Protocole de purification d'ADN génomique de la levure

Pour faciliter la formation de sphéroplastes, il est recommandé de prendre des cellules dans la phase de log, c'est-à-dire 12-16h après l'insémination. Il est possible de prendre des culots cellulaires congelés à -20 °C.

Formation de sphéroplastes

1. Solubiliser un culot de cellule avec 10 ml d'eau distillée.
2. Répartir entre 1 ml et 1,5 ml dans des tubes eppendorfs pour obtenir 100 mg de levures (wet weight). 
   
3. Centrifuger à 5000g pendant 10 min. Enlever le surnageant
4. Solubiliser le culot avec 500 ul de tampon SCE. Ajouter 50 ul Zymolyase (10 U).
5. Incuber 30 min à 30°C idéalement sur un agitateur rotatif à vitesse minimale.
   
6. Centrifuger à 1000 RPM durant 15 min. Les sphéroplastes sont fragiles, attention à ne pas centrifuger trop vite pour éviter la lyse. Enlever le surnageant

Lyse cellulaire

1. Solubiliser le culot de sphéroplastes avec 300 ul de tampon de lyse. Ajouter la Papaïne et le Tween 20. Vortex pendant quelques secondes. Il est possible de remplacer la papaïne par de la Protéinase k ou n'importe quelle protéase à large spectre thermostable. Pour le détergent, on peut utiliser le Triton. Le SDS est à éviter absolument car il précipite avec le guadinium.
   
2. Incuber au thermocycleur à 56°C durant 30 min. Vortex 2 à 3 fois pendant l'incubation. Il est possible d'augmenter l'incubation jusqu'à 1h.
   
3. Centrifuger à 10 000 RPM durant 5 min.
4. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube.

Purification de l'ADN génomique

1. Ajouter 300 ul de buffer Guadinium SCN 6M. Vortex. Le Guadinium crystalise à RT, le mettre dans de l'eau chaud si c'est le cas. Le buffer Guadinium précipite les protéines et délie l'ADN pour qu'il s'accroche à la colonne de silice.
2. Centrifuger dans des tubes eppendorf à 10 000 RPM pendant 10 min.
3. Déposer sur une colonne de silice (eg. Kit Macherey Nagel).
4. Centrifuger 30 s à 11 000g.
5. Premier lavage : ajouter 500 ul de 3M Guadinium SCN et 30% isopropanol.
6. Centrifuger 30 s à 11 000g.
7. Second lavage : ajouter 500 ul de 80% éthanol.
8. Centrifuger 30 s à 11 000g. x2. Changer le tube 2 ml.
9. Ajouter le tampon d'élution (tris à pH superieur à 8). Faire chauffer le tempon à 70°C avant l'élution pour améliorer le rendement. Eluer avec 50-200 ul selon la concentration voulue. Il est possible de laisser incuber quelques minutes ou heures.
10. Centrifuger 30 s à 11 000g. x2
11. Déposer sur gel d'agarose et faire des mesures de Qubit.

Tampons

• SCE : 1 M Sorbitol; 1 mM EDTA; 10 mM sodium citrate buffer, pH 5.8
• Tampon de lyse : 10 mM Tris HCl pH 8, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl
• Tampon de lavage : 3M Guadinium SCN et 30% isopropanol
• Tampon d'élution : 10 mM Tris HCl pH 8, 5

Produits chimiques

• Sorbitol 
• EDTA
• Tris
• Citrate de sodium
• NaCl
• Guadinium SCN
• Isopropanol
• Ethanol
• Tween
• Papaine
• Zymolyase
• colonne de silice
  

Les erreurs qu'on a faites pour que vous n'ayez pas à les refaire

• Le SDS précipite en présence de guadinium, c'est pourquoi on ne l'utilise pas comme détergent
• La lyse uniquement mécanique ou chimique ne fonctionnent pas avec les levures et donnent des rendements très bas. 
• Si vous avez des rendements bas, revoyez la lyse cellulaire. Diminue la quantité de cellule peut aider.
• On a comparé l'action de la Papaïne et de la Proteinase k et l'action est similaire, donc on utilise la Papaïne, car elle est moins chère

Nos inspirations pour ce protocole

Les protocoles pour faire des sphéroplastes de levures, celui de NEB et de Thermo Fisher. Pour l'utilisation des colonnes, on est parti des protocoles du kit de Macherey Nagel. Pour connaitre les solutions utilisées dans ce protocole, on s'est inspiré des solutions de Quiagen proposés par Pipette Jocket.